Μοριακή ανάλυση και ανίχνευση ανθεκτικότητας διαβιβαστών στα εντομοκτόνα

Με βάση μια πολύ πρόσφατη εργασία που δημοσιεύθηκε στο περιοδικό Nature[1], τα κρούσματα και οι θάνατοι από την ελονοσία μειώθηκαν σε ποσοστό 50% από το 2000 έως σήμερα. Ποσοστό έως και 80% αυτής της μείωσης, που αναγάγεται σε 500.000 ζωές ετησίως, οφείλεται στη χρήση εντομοκτόνων και την επιτυχή αντιμετώπιση του κύριου διαβιβαστή της ελονοσίας Anophelesgambiae. Ωστόσο, η βιωσιμότητα του επιτεύγματος αυτού απειλείται σοβαρά από την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα.

Το πρόβλημα της ανθεκτικότητας στον κύριο φορέα της ελονοσίας Anophelesgambiae θεωρείται σήμερα από τον Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) το πιο σημαντικό στις προσπάθειες ελέγχου της ελονοσίας στην Αφρική [2]. Σε ορισμένες περιοχές της Αφρικής υπάρχουν πληθυσμοί κουνουπιών, οι οποίοι είναι εξαιρετικά ανθεκτικοί σε όλα τα εγκεκριμένα σκευάσματα. Οι γνωστοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας είναι οι μεταλλαγές που μειώνουν την ευαισθησία του μοριακού στόχου των εντομοκτόνων καιτα ένζυμα αποτοξικοποίησης που διασπούν και αδρανοποιούν τα εντομοκτόνα πριν φτάσουν στο στόχο. Επιπλέον αυτών, σε πρόσφατες εργασίες μας στο πλαίσιο του FP7 AVECNET (www.avecnet.eu), δείξαμε ότι επιδερμικές διαφοροποιήσεις που μειώνουν την είσοδο του εντομοκτόνου είναι υπεύθυνες για τα πολύ υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας, απέναντι μάλιστα σε δραστικές διαφόρων ομάδων εντομοκτόνων. Συγκεκριμένα, εξαιτίας της δράσης κάποιων ενζύμων ακριβώς κάτω από την επιδερμίδα (oenocytes), γίνεται υπερπαραγωγή λιπιδίων τα οποία συσσωρεύονται στην επιδερμίδα (epicuticularlipids), δημιουργώντας ένα παχύ επιδερμικό στρώμα στα ανθεκτικά έντομα, το οποίο παρεμποδίζει την είσοδο των εντομοκτόνων και την επίδρασή τους στο νευρικό σύστημα.

Στους διαβιβαστές του γένους Aedes, όπως το κουνούπι τίγρης Ae. albopictus και το Ae. aegypti, φορείς του ιού Ζίκα μεταξύ άλλων, έχουν, επίσης, αναπτυχθεί πολύ επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα. Πρόσφατα, ο ΠΟΥ χρηματοδότησε τη σύσταση ενός παγκόσμιου δικτύου (WIN,http://win-network.ird.fr/) για τη μελέτη και αντιμετώπιση του προβλήματος στα συγκεκριμένα είδη, στο οποίο συμμετέχει και η ερευνητική μας ομάδα. Σε πρόσφατες σχετικές εργασίες μας, χαρακτηρίστηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητας του Ae.albopictus στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα [3,4,5]. Βρέθηκε ότι μια γονιδιακή ενίσχυση εστερασών προκαλεί υπεραπαραγωγή του ενζύμου, το οποίο λειτουργεί ως σπόγγος στο νευρικό σύστημα και τα malpighian tubules, απορροφώντας και αδρανοποιώντας τα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα [3,4,5]. Η ανάλυση της συχνότητας και της διασποράς του μηχανισμού παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, αφού φαίνεται ότι τα ανθεκτικά κουνούπια της Φλόριντας είναι ακριβώς ίδια με αυτά της Ελλάδας.Εργασίες για την ανθεκτικότητα του Τίγρη στα πυρεθροειδή αλλά και το diflobenzuron (το μοριακό μηχανισμό δράσης του οποίου πρόσφατα ταυτοποιήσαμε, με την τεχνική CRISPR-CAS9) είναι σε εξέλιξη.

Η έρευνα για την ανθεκτικότητα δημιουργεί εργαλεία για την πρόληψη και την αντιμετώπισή της. Μεταξύ αυτών, τα μοριακά διαγνωστικά, τα οποία διακρίνουν με ασφάλεια την ανθεκτικότητα και συμβάλλουν στη βέλτιστη διαχείριση των προγραμμάτων κουνουποκτονίας βάσει επιστημονικών δεδομένων.Πρόσφατα η ομάδα μας πέτυχε μια σημαντική Ευρωπαϊκή χρηματοδότηση από το Κοινοτικό Πλαίσιο Horizon 2020, για την ανάπτυξη καινοτόμων μοριακών διαγνωστικών για κουνούπια – φορείς ασθενειών. Το ερευνητικό πρόγραμμα (www.dmc-malvec.eu)αφορά στην ανάπτυξη μιας πλήρως αυτοματοποιημένης μοριακής διαγνωστικής πλατφόρμας (Εικόνα 1) για την ανάλυση κουνουπιών, προκειμένου για την εξακρίβωση του είδους τους (φορείς ασθενειών ή όχι), την παρουσία παθογόνων σε αυτά, καθώς και μεταλλαγών και γονιδίων ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα.  Η πλατφόρμα θα αναλύει ταυτόχρονα περίπου 20 μοριακούς δείκτες, τόσο στο επίπεδο του DNA όσο και του RNA, στη λογική «εισαγωγή κουνουπιών – διαγνωστικό αποτέλεσμα» (sample-to-answer), αφού όλα τα στάδια, όπως η εξαγωγή DNA/RNA, η σύνθεση cDNA και η ενίσχυση των μοριακών δεικτών θα γίνεται αυτοματοποιημένα. Το κόστος της διάγνωσης θα είναι μικρό ενώ η διαγνωστική πλατφόρμα θα συνδέεται με κατάλληλο ενσωματωμένο λογισμικό με βάσεις δεδομένων και συστήματα λήψης αποφάσεων (Decision Support Systems). Ο συντονισμός του Έργου θα γίνει από το ΙΜΒΒ-ΙΤΕ, ενώ στην ερευνητική ομάδα συμμετέχει το Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, καθώς και αναγνωρισμένα Ευρωπαϊκά Ινστιτούτα του εξωτερικού, όπως το Γερμανικό HSG (με συντονιστή, και βασικό συντελεστή του έργου τον Κωνσταντίνο Μιτσακάκη), τη Σχολή Τροπικής Ιατρικής του Λίβερπουλ και τη Σχολή Τροπικής Ιατρικής της Ελβετίας.

 

Εικόνα 1: Η διαγνωστική πλατφόρμα (LabDisk), που θα αναπτυχθεί στα πλαίσια του προγράμματος DMC-MALVEC θα αυτοματοποιεί μια σύνθετη μοριακή διαδικασία, σε ένα «δισκάκι» μιας χρήσης, και θα αναλύει το γενετικό υλικό των κουνουπιών, για την ανίχνευση δυνητικών φορέων, ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα και παρασίτων ελονοσίας. Η πλατφόρμα θα συνδέεται μέσω κατάλληλου λογισμικού με βάσεις δεδομένων και συστήματα λήψης αποφάσεων, και θα συμβάλλει στην κατάρτιση βέλτιστων προγραμμάτων καταπολέμησης και τη διαχείριση της ανθεκτικότητας των κουνουπιών – φορέων στα εντομοκτόνα.

may16gr_kurios thema_21

 

 

Βιβλιογραφία
  1. Balabanidou V. Kambouraki N., MacLean M., Blomquist G, Juárez P,  Chalepakis G., Anthousi A.,  Ranson H., Lyccett G., Vontas J. (2016) Cytochrome P450s with intriguing localization catalyse cuticular hydrocarbon production associated with insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae – submitted
  2. Bhatt et al, Nature 527, 207 (2015).
  3. Grigoraki L, Balabanidou V, Meristoudis C, Miridakis A, Stefanou E, Ranson H, Swevers L, Vontas J (2016) Functional and immunohistochemical characterization of CCEae3a, a carboxylesterase associated with temephos resistance in the major arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. Insect Biochemistry and Molecular Biology 74, 61-67
  4. Grigoraki L, Lagnel J, Kioulos I, Kampouraki A, Morou E, Labbé P, Weill M., Vontas J. (2015) Transcriptome Profiling and Genetic Study Reveal Amplified Carboxylesterase Genes Implicated in Temephos Resistance, in the Asian Tiger Mosquito Aedes albopictus. PLoS Negl Trop Dis 9(5): e0003771. doi:10.1371/journal.pntd.0003771
  5. Hemingway J, J Vontas, R Poupardin, J Raman, J Lines, C Schwabe, A Matias, and I Kleinschmidt (2013) Country-level operational implementation of the Global Plan for Insecticide Resistance Management. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 9397-9402.
  6. Vontas J, S Moores, I Kleinschmidt, H Ranson, S Lindsay, C Lengeler, N Hamon, T McLean, and J Hemingway (2014) A Logical Framework for assessment and adoption of new vector control product categories. Trends in Parasitology: doi: 10.1016/j.pt.2014.02.005.
  7. X Chen, X Jiang, J Gu, M Xu, Y Wu, Y Deng , C Zhang, M Bonizzoni, W Dermauw, J Vontas, P Armbruster, X Huang,Y Yang, Z Hao, W He, H Peng, Y Liu, K Wu, J Chen, M Lirakis, P Topalis, T Van Leeuwen, A B Hall, X Jiang, C Thorpe, R L Mueller, C Sun, R M Waterhouse, G Yan, Z J Tu, X Fang, A A. James (2015) The genome sequence of the Asian Tiger mosquito, Aedes albopictus,reveals insights into its biology, genetics and evolution.  PNAS (in press) doi: 10.1073/pnas.1516410112 PMID: 26483478

Γιάννης Βόντας, Εργ Γ Φαρμακολογίας, Τμήμα Επ Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα
Εργ. Μοριακής Εντομολογίας, Ινστ Μορ Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας, ϊδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας, Ηράκλειο, Κρήτη