Τυποποίηση στελεχών L. monocytogenes

Η L. monocytogenes είναι ένα «γοητευτικό» μικρόβιο. Με μια γρήγορη ματιά είναι ένα αθώο, ειρηνικό Gram θετικό μικρόβιο, διασπαρμένο παντού στο περιβάλλον. Η αφθονία του αυτή μπορεί να οδηγήσει σε εφησυχασμό. Ωστόσο, κάτω από αυτήν την ευγενική εμφάνιση αποκαλύπτεται ένα θανατηφόρο ενδοκυττάριο βακτήριο, το οποίο έχει την ικανότητα να επιβιώνει σε δυσμενείς και ακραίες συνθήκες (π.χ. χαμηλό pH, χαμηλές θερμοκρασίες, σε πολλές διαδικασίες επεξεργασίας τροφίμων) καθιστώντας το ένα πολύ επικίνδυνο τροφιμογενές παθογόνο μικρόβιο. Η  L. monocytogenes  είναι αδιαμφισβήτητα στον κόσμο των μικροβίων ο «κακός λύκος ντυμένος αρνί» ή «Dr Jekyll & Mr. Hyde» [1].

 

Listeria monocytogenes είναι ένα παθογόνο που μπορεί να προκαλέσει σοβαρές ασθένειες σε ευπαθή άτομα, δηλαδή έγκυες γυναίκες, νεογνά, ηλικιωμένους και ανοσοκατασταλμένους. Αν και η λιστερίωση έχει χαμηλή επίπτωση, ωστόσο η υψηλή θνητότητα  (20-30%) καθιστά τη Listeria monocytogenes ένα μικρόβιο επικίνδυνο για τη δημόσια υγεία.

 

Λόγω της σημασίας της  L.monocytogenes, είναι αναγκαίος ο περαιτέρω χαρακτηρισμός κάθε καλλιεργήματος με τυποποιητικές μεθόδους τόσο για τη διερεύνηση επιδημιών όσο και για την επιδημιολογική επιτήρηση των στελεχών σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, και  γεωγραφικές περιοχές , αλλά και από διαφορετικές πηγές απομόνωσης (ανθρώπινα/ ζωικά/ τροφιμογενή στελέχη), αλλά και για τη μελέτη της πηγής και της πορείας επιμόλυνσης σε μονάδες επεξεργασίας τροφίμων.

 

Διάφορες τυποποιητικές μέθοδοι καλλιεργημάτων L. monocytogenes αναπτύχθηκαν  και βελτιώθηκαν τις τελευταίες δεκαετίες, με σαφή τάση μετακίνησης από τις φαινοτυπικές στις γονοτυπικές μεθόδους. Όλες οι μέθοδοι έχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, γι’ αυτό και καμιά μέθοδος δε θεωρείται ως «ιδανική» από μόνη της. Πάντα ένας συνδυασμός τυποποιητικών μεθόδων, μαζί με τα επιδημιολογικά δεδομένα, δίνουν καλύτερα και πιο αξιόπιστα αποτελέσματα.

 

Φαινοτυπικές μέθοδοι

Οι φαινοτυπικές μέθοδοι διαχωρίζουν τα καλλιεργήματα βάσει του φαινότυπού τους, που είναι αποτέλεσμα βέβαια της γονιδιακής έκφρασης. Κλασικές τυποποιητικές μέθοδοι είναι η βιοτυπία, η οροτυπία, ο έλεγχος αντοχής σε αντιβιοτικά , η λυσιτυπία κ.ά.

Η οροτυπία αποτελεί τη βασικότερη φαινοτυπική μέθοδο τυποποίησης της λιστέριας. Η μέθοδος βασίζεται στην ανίχνευση επιφανειακών αντιγόνων του κυτταρικού τοιχώματος (σωματικά αντιγόνα –Ο) και των μαστιγίων (flagellar –H). Από το συνδυασμό των αντιγόνων αυτών προκύπτει ο ορότυπος. Μέχρι στιγμής έχουν περιγραφεί 12 διαφορετικοί ορότυποι (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e και 7) [2]. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι η  υψηλή τυποποιητικότητα και το χαμηλό ποσοστό διασταυρούμενων αντιδράσεων. Ωστόσο, η διακριτική ισχύς της μεθόδου είναι σχετικά χαμηλή. Πράγματι, έχει παρατηρηθεί ότι οι ορότυποι  1 / 2a, 1 / 2b και 4b είναι υπεύθυνοι για το 98% των λιστεριώσεων στον άνθρωπο, ενώ οι ορότυποι 4a και 4c σπάνια συνδέονται με την εμφάνιση της νόσου. Το 2004 οι Doumith et al. [3] πρότειναν τη μοριακή οροτυποποίηση των καλλιεργημάτων λιστέριας με εφαρμογή μιας multiplex PCR, οπότε και  η μέθοδος αυτή προτείνεται στα Κέντρα Αναφοράς από το ECDC.

 

Μοριακές μέθοδοι

Οι μοριακές μέθοδοι έχουν ως στόχο την παραγωγή ενός μοναδικού μοριακού – DNA αποτυπώματος (fingerprint) για κάθε καλλιέργημα. Από τις κλασικές μεθόδους θεωρείται η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης του DNA του παθογόνου σε παλλόμενο πεδίο (PFGE) μετά από πέψη του με «μοριακά ψαλίδια». Η μέθοδος στηρίζεται στην πέψη του γονιδιώματος των βακτηρίων  με περιοριστικές ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν σπάνιες παλίνδρομες αλληλουχίες DNA (rare cutters). Τα παραγόμενα θραύσματα DNA είναι λίγα (10-20) και μεγάλα (20 kb έως 10000 kb). Τα θραύσματα αυτά διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου. Οι διαφορές στον αριθμό και στο μήκος (kb) των θραυσμάτων δημιουργεί διαφορετικά προφίλ για κάθε διαφορετικό καλλιέργημα. Οι διαφορές στα προφίλ χρησιμοποιούνται για να γίνουν αναλύσεις και συγκρίσεις με τη βοήθεια του λογισμικού Bionumerics [4]. Η PFGE πλέον χρησιμοποιείται σαν «gold standard» μέθοδος τυποποίησης τροφιμογενών βακτηρίων, όπως Salmonella, E.coli, Campylobacter, Yersinia, Vibrio και Listeria. Στα Εργαστήρια Αναφοράς εφαρμόζονται Standardised Operating Procedures (SOPs) που προτείνει η PulseNet, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα [5]. Η PFGE είναι μέθοδος με υψηλή αναπαραγωγιμότητα, καλή διακριτική ισχύ και επιδημιολογική ταύτιση. Ωστόσο, απαιτείται πολύς χρόνος (συνολικά > 30 ώρες) για να πραγματοποιηθεί, το κόστος εφαρμογής είναι υψηλό και ακόμα και με τήρηση των SOP είναι αρκετά δύσκολο να τυποποιηθεί μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων .

 

« Η αλληλούχιση όλου του γονιδιώματος οδηγεί στην επιτήρηση τροφιμογενών λοιμώξεων της επόμενης γενιάς» (ESCΑIDE, Στοκχόλμη, 2014)

 

Οι μέθοδοι που στηρίζονται στην ανάλυση ολόκληρης της αλληλουχίας DNA (whole genome sequencing-WGS) κάθε καλλιεργήματος,  με την εξέλιξη της τεxνολογίας του next generation sequencing, κερδίζουν  έδαφος πια, ως πολλά υποσχόμενες μέθοδοι τυποποίησης,  για τη διερεύνηση τροφιμογενών επιδημιών, την επιδημιολογική επιτήρηση των τροφιμογενών παθογόνων μικροβίων, αλλά και για τη μελέτη της εξελικτικής τους πορείας (φυλογενετικές σχέσεις). Η L. monocytogenes είναι από τα πρώτα μικρόβια που μελετήθηκαν με αναλύσεις που στηρίζονται στο WGS, όπως η Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ανάλυση και η MLST, για διερεύνηση τροφιμογενών επιδημιών. Η L. monocytogenes επιλέχθηκε, γιατί η διεισδυτική λιστερίωση είναι νόσος σοβαρή, υψηλού συνολικού κόστους, οι μέχρι τώρα μέθοδοι τυποποίησης του μικροβίου δεν έχουν υψηλή διακριτική ισχύ και δε δίνουν πληροφορίες για εξελικτικές σχέσεις μεταξύ διαφορετικών στελεχών. Επίσης, το γονιδίωμα της L. monocytogenes είναι αρκετά μικρό  (2.9 Μb) και άρα σχετικά εύκολο να γίνει αλληλούχισή του [6,7].

H WGS αναμένεται να γίνει η μοναδική μέθοδος για τη μοριακή τυποποίηση των τροφιμογενών μικροβίων, μαζί με επιπλέον φαινοτυπικές δοκιμασίες, όπως ο έλεγχος αντοχής σε αντιβιοτικά [6].

 

Από το 2015 το Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας, σε συνεργασία με το ΚΕΕΛΠΝΟ, ανέλαβε την τυποποίηση (οροτυπία και PFGE) των καλλιεργημάτων λιστέριας που αποστέλλονται από τα μικροβιολογικά νοσοκομεία της Ελλάδας, με σκοπό την επιδημιολογική επιτήρηση της λιστέριας , αλλά και για τη διερεύνηση της αύξησης συρροών κρουσμάτων λιστερίωσης που παρατηρείται από το προηγούμενο έτος.

 

Το Δίκτυο Τροφιμογενών Λοιμώξεων (Food and Water borne Disease Network) του ECDC επέλεξε τη L. monocytogenes ως το πρώτο τροφιμογενές μικρόβιο, για το οποίο θα δημιουργηθεί σε ευρωπαϊκό επίπεδο βάσει δεδομένων WGS, με σκοπό την επιτήρηση του μικροβίου, αλλά και την ανίχνευση επιδημιών. Το πρόγραμμα  που ονομάστηκε ELiTE (European Listeria Typing Exercise) αναλύει στελέχη που απομονώθηκαν από ανθρώπους και τρόφιμα,  από τα κράτη της Ευρώπης, από το 2013 και μετά, έτσι ώστε να γίνει δυνατή η σύγκριση μεταξύ στελεχών διαφορετικής προέλευσης.

 

Συμπερασματικά, η εργαστηριακή και επιδημιολογική επιτήρηση των καλλιεργημάτων  L. monocytogenes που απομονώνεται από ανθρώπους, ζώα και τρόφιμα είναι πολύ σημαντική για την προστασία της δημόσιας υγείας, και συνεπώς, παράλληλα με τη δήλωση των κρουσμάτων στο ΚΕΕΛΠΝΟ,  ενθαρρύνεται η αποστολή των μικροβίων που απομονώνονται από τα μικροβιολογικά εργαστήρια στο ΕΚΑΣ για την ολοκληρωμένη τυποποίησή τους.

 

Βιβλιογραφία
  1. Handbook of Listeria monocytogenes. 2008, CRC Press Taylor and Francis Group
  2. Liu D. (2006) Identification, subtyping and virulence determination of  Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. J Med  Microbiol. ;55(Pt 6):645-59. Review.
  3. Doumith M, Buchrieser C, Glaser P, Jacquet C, Martin P. (2004) Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. J Clin Microbiol.;42(8):3819-22.
  4. van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, Haeggman S, Cookson B, Fry NK, Fussing V, Green J, Feil E, Gerner-Smidt P, Brisse S, Struelens M; European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM).  (2007) Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. Clin Microbiol Infect. ΄3:1-46.
  5. http://www.pulsenetinternational.org/protocols/
  6. ECDC Scientific Advice: Expert Opinion on the introduction of next-generation typing methods for food- and waterborne diseases in the EU and EEA. (http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/food-and-waterborne-diseases-next-generation-typing-methods.pdf)
  7. Kwong JC, Mercoulia K, Tomita T, Easton M, Li HY, Bulach DM, Stinear TP, Seemann T, Howden BP.(2016). Prospective Whole-Genome Sequencing Enhances National Surveillance of Listeria monocytogenes. J Clin Microbiol. ;54(2):333-42

Μανδηλαρά Γεωργία, Βιολόγος PhD, Επιστημονική Υπεύθυνη,
Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών, Σιγκελλών, βερο-τοξινογόνων E.coli, Λιστέριας, ΕΣΔΥ-ΚΕΔΥ-ΚΕΕΛΠΝΟ