Λιστερίωση και μέθοδοι ανίχνευσης Listeria spp. στα ζώα

Πληθώρα οικόσιτων και άγριων ζώων, συμπεριλαμβανομένων και των πτηνών, μπορεί να προσβληθούν από παθογόνα είδη του γένους Listeria (L. monocytogenes και L. ivanovii) [1-4]. Σε πολλές περιπτώσεις η λοίμωξη στα ζώα είναι υποκλινική. Η κλινική μορφή της νόσου εκδηλώνεται, συνήθως, στα οικόσιτα μηρυκαστικά (αίγες, πρόβατα και βοοειδή), και με μικρότερη συχνότητα σε άλλα είδη ζώων [5-9]. Η νόσος στα μηρυκαστικά σχετίζεται συχνά με την κατανάλωση αποθηκευμένων ζωοτροφών (ενσιρώματα) κακής ποιότητας (pH> 5,5) [10]. Τα τελευταία έτη αναγνωρίστηκαν 11 νέα είδη Listeria spp., με το συνολικό αριθμό ειδών να ανέρχεται σήμερα στα 17 [11]. Τα νέα αυτά είδη δεν έχουν χαρακτηριστεί επαρκώς. Ωστόσο, με βάση την απουσία συγκεκριμένων παραγόντων παθογένειας στο γονιδίωμά τους, θεωρούνται απαθογόνα για τον άνθρωπο και τα ζώα. Τα στελέχη L. monocytogenes διακρίνονται σε τέσσερις (I, II, III και IV) φυλογενετικές γραμμές (geneticlineages), με εκείνα που ανήκουν στις γραμμές ΙΙΙ και ΙV να είναι σπανιότερα και να απομονώνονται, συνήθως, από ζώα [12].

Τα κλινικά περιστατικά είναι, συνήθως, σποραδικά και αφορούν μόνο ένα ζώο στο κοπάδι, ενώ σπανιότερα έχουν τη μορφή επιζωοτίας. Στα περισσότερα κλινικά κρούσματα η νόσος εμφανίζεται με τη νευρική της μορφή (φλεγμονή του ρομβοειδούς εγκεφάλου) [7, 13-14]. Οι άλλες κύριες μορφές της νόσου στα ζώα είναι η σηψαιμική (συνήθως στα νεογέννητα) και οι αποβολές σε προχωρημένα στάδια εγκυμοσύνης (μετά τους 7 μήνες κύησης στις αγελάδες και μετά τις 12 εβδομάδες κύησης στις προβατίνες) [15]. Σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις, η νόσος στα μηρυκαστικά εκδηλώνεται ως γαστρεντερίτιδα, μαστίτιδα ή οφθαλμίτιδα [16-20]. Οι περισσότερες περιπτώσεις λιστερίωσης στα ζώα οφείλονται στη L. monocytogenes. Ωστόσο, και η L. ivanovii μπορεί να προκαλέσει αποβολές σε αγελάδες και προβατίνες [21-22].

Η λιστερίωση των ζώων είναι νόσος υποχρεωτικής δήλωσης στην Ελλάδα. Για τη διάγνωση της νόσου, το υλικό που πρέπει να σταλεί στο εργαστήριο ποικίλλει ανάλογα με την κλινική μορφή της νόσου. Για τη σηψαιμική μορφή πρέπει να αποσταλούν αίμα ή ιστοί που λαμβάνονται μετά από νεκροτομή (αλλοιώσεις ήπατος, νεφρών, σπλήνας)· σε περιπτώσεις νευρικής μορφής πρέπει να αποσταλεί εγκεφαλονωτιαίο υγρό και στέλεχος εγκεφάλου ή προμήκης· σε περιπτώσεις αποβολών, τα δείγματα προς αποστολή μπορεί να είναι πλακούντας, αμνιακό υγρό, εμβρυικοί ιστοί ή εκκρίσεις της μήτρας [23]. Τα δείγματα αυτά πρέπει να συντηρούνται υπό ψύξη κατά τη μεταφορά τους στο εργαστήριο. Τα νεκροτομικά ευρήματα στη νευρική μορφή της νόσου μπορεί να είναι θολερότητα του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και παθητική υπεραιμία των αγγείων των μηνίγγων, χωρίς ιδιαίτερα εμφανείς μακροσκοπικές αλλοιώσεις (ήπιος αποχρωματισμός του στελέχους του εγκεφάλου, παθητική υπεραιμία και ενίοτε παρουσία αποστημάτων και μαλάκυνση του προμήκη). Στη σηψαιμική μορφή μπορεί να παρατηρηθούν πολλαπλές νεκρωτικές εστίες στο ήπαρ και σπανιότερα στη σπλήνα [23].

Η εργαστηριακή διάγνωση μπορεί να γίνει μέσω της καλλιέργειας και απομόνωσης του παθογόνου από φυσιολογικώς στείρα σωματικά υγρά (εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή αίμα) ή ιστούς (ήπαρ, εγκέφαλος). Ειδικότερα σε περιπτώσεις εγκεφαλίτιδας, η διάγνωση μπορεί να βασιστεί στην παρουσία παθογνωμονικών ιστολογικών αλλοιώσεων (εστίες συλλογής ουδετερόφιλων και μακροφάγων στο στέλεχος του εγκεφάλου με γειτονικές περιαγγειακές συλλογές μονοπύρηνων) σε μονιμοποιημένα παρασκευάσματα εγκεφαλικού ιστού.

Υπάρχουν πολλές συμβατικές, αλλά και ταχείες μικροβιολογικές μέθοδοι για την ανίχνευση και ταυτοποίηση της L. monocytogenes. Παρόλα τα μειονεκτήματά τους (π.χ. μεγάλο χρονικό διάστημα για λήψη αποτελέσματος, υποκειμενικότητα στην εκτίμηση των αποτελεσμάτων των βιοχημικών δοκιμών), οι συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι είναι σημαντικές για τη διάγνωση της λιστερίωσης στα ζώα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, ο μικροοργανισμός που λαμβάνεται σε καθαρή καλλιέργεια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για επιδημιολογικούς σκοπούς, αλλά και για τη διαχείριση πιθανής επιζωοτίας (π.χ. έλεγχος ανθεκτικότητας σε αντιμικροβιακούς παράγοντες, επιλογή θεραπευτικού σχήματος, τυποποίηση του μικροοργανισμού).

Η απομόνωση του παθογόνου με άμεση επίστρωση σε απλά εργαστηριακά θρεπτικά υποστρώματα (π.χ. αιματούχο άγαρ – η L. monocytogenes είναι ασθενώς β-αιμολυτικός μικροοργανισμός) είναι σχετικά εύκολη όταν το παθογόνο βρίσκεται σε υψηλούς πληθυσμούς σε σωματικά υγρά ή ιστούς που υπό φυσιολογικές συνθήκες είναι απαλλαγμένα από μικροοργανισμούς, όπως εκείνα που προαναφέρθηκαν στη σηψαιμική μορφή της νόσου. Ωστόσο, η απομόνωση του παθογόνου είναι δυσκολότερη όταν αυτό βρίσκεται σε χαμηλούς πληθυσμούς στα υπό εξέταση δείγματα (όπως συνήθως στη νευρική μορφή της νόσου) ή όταν τα προς εξέταση δείγματα είναι μικροβιοβριθή (π.χ. κόπρανα). Σε περιπτώσεις εξέτασης μικροβιοβριθών δειγμάτωνακολουθούνται πρωτόκολλα εμπλουτισμού (χρήση προ-εμπλουτιστικών ή και εμπλουτιστικών ζωμών) και γίνεται χρήση εκλεκτικών στερεών υποστρωμάτων [25]. Τα επόμενα στάδια ταυτοποίησης μπορεί να βασίζονται είτε στη μορφολογία των αποικιών (π.χ. κυανοπράσινες αποικίες στο υπόστρωμα ALOA που περιβάλλονται από άλω για τις L. monocytogenes και L. ivanovii) σε συνδυασμό με απλές βιοχημικές δοκιμές και μικροσκοπικό έλεγχο [δοκιμή καταλάσης, είδος αιμόλυσης, χαρακτηριστική κινητικότητα σε νωπά παρασκευάσματα (tumbling motility), δοκιμή CAMP, προφίλ ζύμωσης σακχάρων] [26] είτε σε μεθόδους που χρησιμοποιούν αντισώματα (π.χ. ELISA, ανοσολογικές δοκιμές δέσμευσης αντιγόνων, ταινίες επικαλυμμένες με αντισώματα). Η «κλασική» μέθοδος του ψυχρού εμπλουτισμού δε χρησιμοποιείται πλέον [27]. Υπάρχουν πολλά πρότυπα πρωτόκολλα για την ανίχνευση της L. monocytogenes, όπως εκείνα των Οργανισμών FDA [28], AOAC [29], CEN-ISO [30-31] και USDA-FSIS [32]. Αξίζει ωστόσο να σημειωθεί ότι τα πρωτόκολλα αυτά έχουν αναπτυχθεί και επικυρωθεί για χρήση σε τρόφιμα και περιβαλλοντικά δείγματα, και δεν υπάρχουν δημοσιευμένα αποτελέσματα σε ό,τι αφορά την απόδοσή τους σε περιπτώσεις εξέτασης κλινικών δειγμάτων. Επίσης, η μέθοδος CEN-ISO τελεί επί του παρόντος υπό αναθεώρηση και το αναθεωρημένο πρότυπο αναμένεται να δημοσιευτεί μέσα στο 2016. Για δείγματα που λαμβάνονται από νεκροψία υπάρχει ένα πρωτόκολλο που βασίζεται επίσης σε εκλεκτικό εμπλουτισμό [33], καθώς και πρωτόκολλα που εφαρμόζονται σε εθνικό επίπεδο στα αντίστοιχα εργαστήρια αναφοράς [23]. Πολλές ταχείες, ενναλακτικές μέθοδοι ταυτοποίησης, συμπεριλαμβανομένων μοριακών μεθόδων (π.χ. PCR-αλληλούχηση, φασματομετρία μάζας MALDI-TOF) και εμπορικών μεθόδων (kits), έχουν περιγραφεί και εφαρμοστεί για την ταυτοποίηση των Listeria spp. [23].

Η τυποποίηση στελεχών Listeria spp. από κλινικά δείγματα ζώων δεν αποτελεί συνήθη πρακτική. Ωστόσο, υπάρχουν πολλές προσεγγίσεις και μέθοδοι για την τυποποίηση και υπο-τυποποίηση στελεχών L. monocytogenes για επιδημιολογικούς σκοπούς [34]. Οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιούνται συχνά (όπως συχνή είναι εξάλλου και η μεταξύ τους σύγκριση) σε περιπτώσεις στελεχών που απομονώνονται από τρόφιμα και κλινικά ανθρώπινα δείγματα. Οι μέθοδοι αυτές διαφέρουν ως προς τη διακριτική τους ικανότητα/ισχύ (discriminatory power), αλλά και ως προς την ικανότητά τουςσε ότι αφορά την ανίχνευση επιδημιολογικής σύνδεσης (epidemiological concordance). Η οροτυποποίηση μπορεί να γίνει είτε με την κλασική μέθοδο, χρησιμοποιώντας ειδικούς αντιορούς (και η οποία διαφοροποιεί τα Listeria spp. σε 13 ορότυπους) ή μέσω πολυπλεκτικής (multiplex) PCR, η οποία διαχωρίζει τα στελέχη σε 5 μοριακές οροομάδες (moleculars erogroups) [35-37]. Δεδομένης της χαμηλής διακριτικής ικανότητας της οροτυποποίησης έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί πρόσθετες μέθοδοι τυποποίησης. Σε αυτές περιλαμβάνονται η λυσιτυπία (phage-typing), αλλά και μέθοδοι που βασίζονται είτε α) στην ανάλυση του πολυμορφισμού του μήκους των θραυσμάτων που παράγονται ύστερα από δράση περιοριστικών ενδονουκλεασών στο DNA (“fragment-based” methods), π.χ.RFLP, ριβοτυπία (ribotyping), ηλεκτροφόρηση σε εναλλασσόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) είτε β) στην αλληλούχηση του γενετικού υλικού (nucleic-acid “sequence-based” approaches), όπως η πολυτοπική ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (MLST) [38]. Το Εργαστήριο Αναφοράς της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τη L. monocytogenes (EURL) στη Γαλλία συνεργάζεται με ένα δίκτυο 35 εθνικών εργαστηρίων αναφοράς στην Ευρώπη. Τα περισσότερα από τα εργαστήρια αυτά είναι υπεύθυνα για την ανίχνευση και τυποποίηση στελεχών L. monocytogenes που απομονώνονται σε εθνικό επίπεδο από τρόφιμα, περιβαλλοντικά δείγματα και ζώα. Πρόσφατα το EURL δημιούργησε μια βάση δεδομένων για τη L. monocytogenes, στην οποία κάθε εθνικό εργαστήριο καταθέτει δεδομένα τυποποίησης (PFGE και οροτυποποίηση) των στελεχών που απομονώνονται αλλά και σχετικά επιδημιολογικά στοιχεία [39].

Για πολλά χρόνια η μέθοδος PFGE αποτελεί τη «χρυσή σταθερά» (“goldstandard”) αναφορικά με την επιδημιολογική διερεύνηση περιστατικών L. monocytogenes [40-41]. Ωστόσο, οι μέθοδοι τυποποίησης που βασίζονται στην αλληλούχηση του γενετικού υλικού, και ιδιαίτερα η μέθοδος αλληλούχησης ολόκληρου του γενώματος (whole-genome sequencing, WGS) εφαρμόζεταιόλο και πιο συχνά τα τελευταία χρόνια για την τυποποίηση στελεχών που απομονώθηκαν από ανθρώπους και τρόφιμα, ενώ σχετικές συγκριτικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι διαθέτει μεγαλύτερη διακριτική ισχύ σε σχέση με την PFGE [42-47].

Απόστολος Αγγελίδης, Κτηνίατρος, MPVM, PhD, Επίκουρος καθηγητής Εργαστήριο Γαλακτοκομίας, Τομέας Υγιεινής και Τεχνολογίας Τροφίμων Ζωικής Προέλευσης, Τμήμα Κτηνιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, ΑΠΘ