Εργαστηριακή διάγνωση μη τυφοειδούς σαλμονέλλωσης – Ταυτοποίηση

Η σαλμονέλλα εξακολουθεί να αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο τροφιμογενών λοιμώξεων [1]. Τα άτομα που νοσούν από σαλμονέλλωση παρουσιάζουν συμπτώματα γαστρεντερίτιδας (διάρροια, κοιλιακό πόνο, εμετούς, πυρετό). Η εργαστηριακή διάγνωση της σαλμονέλλας γίνεται με καλλιέργεια κοπράνων ή αίματος σε περιπτώσεις μικροβιαιμίας, σε μικροβιολογικό εργαστήριο. Καλλιέργεια κοπράνων είναι η εργαστηριακή διαδικασία για την απομόνωση του μικροβίου και κατόπιν την ταυτοποίηση του, δηλαδή την κατάταξη του απομονωθέντος μικροοργανισμού σε συγκεκριμένο γένος και είδος. Η συνήθης βακτηριακή καλλιέργεια κοπράνων περιλαμβάνει την τοποθέτηση (εμβολιασμό) ενός δείγματος κοπράνων σε εμπλουτιστικά (π.χ. Gram Negative Broth, Selenite Broth) και εκλεκτικά μέσα (π.χ. Hoekten agar, XLD agar, Brilliant Green agar για τη σαλμονέλλα) που περιέχουν θρεπτικά συστατικά, τα οποία επιτρέπουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση της σαλμονέλλας από άλλα εντεροβακτηριακά. Οι αποικίες που εμφανίζει η σαλμονέλλα έχουν συγκεκριμένα μορφολογικά και καλλιεργητικά χαρακτηριστικά, και έχουν συγκεκριμένες μεταβολικές ιδιότητες (π.χ. διάσπαση υποστρωμάτων, παραγωγή ενζύμων κ.ά). Η περαιτέρω ταυτοποίηση των ύποπτων αποικιών πραγματοποιείται με βιοχημικές δοκιμασίες, ενώ η τελική ταυτοποίηση απαιτεί ορολογική επιβεβαίωση. Συνήθως πραγματοποιείται ανακαλλιέργεια ύποπτων αποικιών σε κεκλιμένους σωλήνες Kligler iron agar ή Triple Sugar Iron agar για έλεγχο ζύμωσης της γλυκόζης και της λακτόζης. Η σαλμονέλλα ζυμώνει τη γλυκόζη με παραγωγή αερίου και H2S, αλλά όχι τη λακτόζη (κόκκινη λοξή επιφάνεια, μαύρη στήλη με παρουσία φυσαλίδων) . Η ορολογική ταυτοποίηση, δηλαδή ο έλεγχος της παρουσίας σωματικών αντιγονικών (O-antigens) πραγματοποιείται με τη μέθοδο της οροσυγκόλλησης (έλεγχος με πολυδύναμο αντιορό σωματικών αντιγόνων, ομάδων Α-67, σύμφωνα με το σχήμα Kauffmann-White-Le Minor) θεωρείται απαραίτητη για την τελική κατάταξη του μικροοργανισμού στο γένος Salmonella spp. H όλη διαδικασία απαιτεί 3 – 5 ημέρες.

Τυποποίηση σαλμονελλών

Η εργαστηριακή επιδημιολογική επιτήρηση των λοιμώξεων από σαλμονέλλα είναι πολύ σημαντικό «όπλο» για την προστασία της δημόσιας υγείας. Η συνεχής και συστηματική συλλογή, ανάλυση και ερμηνεία όλων των δεδομένων που αφορούν στην εμφάνιση και εξάπλωση των διαφόρων τύπων σαλμονελλών είναι απαραίτητες διαδικασίες για το σχεδιασμό, την εφαρμογή και την αξιολόγηση των παρεμβάσεων δημόσιας υγείας με τελικό στόχο τον αποτελεσματικό έλεγχο των σαλμονελλώσεων.

 

Οι βασικοί στόχοι της εργαστηριακής επιδημιολογικής επιτήρησης είναι :

  • H συνεχής καταγραφή της συχνότητας των σαλμονελλώσεων, καθώς και της σχετικής συχνότητας των διαφόρων κλώνων (όπως αυτός καθορίζεται απο τον ορότυπο, το φαινότυπο αντοχής ή μοριακά από τον PFGE τύπο).
  • Η έγκαιρη αναγνώριση και διερεύνηση επιδημιών, π.χ. συρροή κρουσμάτων ενός συγκεκριμένου μικροβιακού κλώνου, ώστε να λαμβάνονται άμεσα τα κατάλληλα μέτρα.
  • Η έγκαιρη προειδοποίηση για αλλαγές στη συχνότητα σαλμονελλώσεων από συγκεκριμένα στελέχη σαλμονελλών.

 

Αυτό επιτυγχάνεται με τη διαδικασία της τυποποίησης (typing) των καλλιεργημάτων, δηλαδή της φαινοτυπικής ή/και γονοτυπικής ανάλυσής τους με σκοπό την παραγωγή και αναγνώριση “αποτυπώματος” (fingerprint) ειδικού για κάθε στέλεχος (strain) ή κλώνο (clone).

Η εργαστηριακή επιδημιολογική επιτήρηση των σαλμονελλώσεων πραγματοποιείται στο Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών (ΕΚΑΣ), στον Τομέα Μικροβιολογίας της ΕΣΔΥ. Το ΕΚΑΣ εντάσσεται στη σύμπραξη μεταξύ ΕΣΔΥ-ΚΕΕΛΠΝΟ και λειτουργεί μαζί με το Κεντρικό Εργαστήριο Δημόσιας Υγείας στη Βάρη.

Τα επιβεβαιωμένα καλλιεργήματα Salmonella spp. αποστέλλονται από τα μικροβιολογικά εργαστήρια νοσοκομείων και διαγνωστικών κέντρων στο EKAΣ. Αν και η δήλωση των σαλμονελλώσεων στο Γραφείο Τροφιμογενών του ΚΕΕΛΠΝΟ είναι υποχρεωτική, η αποστολή των καλλιεργημάτων στο ΕΚΑΣ είναι προαιρετική, ωστόσο γίνεται προσπάθεια εβδομαδιαίας αντιπαραβολής δεδομένων μεταξύ ΕΚΑΣ-ΚΕΕΛΠΝΟ και ενεργητική αναζήτηση των καλλιεργημάτων από τα μικροβιολογικά εργαστήρια.

Τα καλλιεργήματα που αποστέλλονται στο ΕΚΑΣ συνοδεύονται από ένα επιδημιολογικό δελτίο, στο οποίο δίνονται πληροφορίες για τον ασθενή (ονοματεπώνυμο, ηλικία, φύλο, ημερομηνία απομόνωσης, πρόσφατο ταξίδι, υλικό απομόνωσης).

Ρόλος του ΕΚΑΣ είναι ο ολοκληρωμένος χαρακτηρισμός των καλλιεργήματων σαλμονέλλας που αποστέλονται, δηλαδή:

  • ορολογική τυποποίηση (σύμφωνα με το σχήμα Kaufmmann-White-Le Minor) [2]
  • προσδιορισμός φαινοτύπου αντοχής σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά, τα οποία έχουν καθοριστεί από το ECDC- σύμφωνα με τη EUCAST μέθοδο, και μοριακή ανίχνευση των bla γονιδίων, όταν παρατηρηθεί παραγωγή β-λακταμασών [3]
  • μοριακή τυποποίηση με τη μέθοδο της Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) [4].

 

Το ΕΚΑΣ διατηρεί τράπεζα στελεχών των σαλμονελλών από το 1996 μέχρι σήμερα.

Όλα τα δεδομένα που προκύπτουν από τους παραπάνω εργαστηριακούς ελέγχους μαζί με τα επιδημιολογικά δεδομένα (Γραφείο Τροφιμογενών – ΚΕΕΛΠΝΟ) για κάθε καλλιέργημα σαλμονέλλας καταγράφονται σε μια τράπεζα δεδομένων του ΕΚΑΣ, ενώ τα βασικά στατιστικά δεδομένα αναρτώνται ετησίως στο www.mednet.gr/whonet/, αλλά και αποστέλλονται στο “The European Surveillance System –TESSy”, σε τακτική και καθορισμένη από το ECDC συχνότητα προς εκπλήρωση των υποχρεώσεων της Ελλάδας όσον αφορά στη συλλογή δεδομένων επιτήρησης λοιμωδών νοσημάτων από τις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, στο πλαίσιο του ευρωπαϊκού κανονισμού 851/2004.

Τα δεδομένα που συλλέγονται από το TESSy   για τα κλινικά καλλιεργήματα σε συνεργασία με την Ευρωπαϊκή Αρχή Ασφάλειας Τροφίμων (EFSA) για τα κτηνιατρικά αλλά και καλλιεργήματα σαλμονελλών από τρόφιμα ζωικής προέλευσης δημοσιεύονται ετησίως [1]. Τα δεδομένα για τη μικροβιακή αντοχή δημοσιεύονται σε ξεχωριστή έκθεση [5].

Στο πλαίσιο της προσπάθειας από το ECDC για την ενιαία πολιτική υγείας στις ευρωπαϊκές χώρες βάσει της “One Health” προσέγγισης, τίθεται ως προτεραιότητα δημόσιας υγείας η αντιμετώπιση της μικροβιακής αντοχής και η υπεύθυνη χρήση αντιβιοτικών στον άνθρωπο και στην κτηνοτροφία. Για αυτό το λόγο το ΕΚΑΣ συνεργάζεται πολύ στενά με το αντίστοιχο Κτηνιατρικό Κέντρο Αναφοράς της Χαλκίδας, με σκοπό τη συχνή ανταλλαγή δεδομένων και την ενσωμάτωση των δεδομένων αντοχής των κτηνιατρικών καλλιεργημάτων σαλμονελλών σε κοινή βάση δεδομένων (www.mednet.gr/whonet/).

Τέλος το ΕΚΑΣ μέσω του “Epidemic Intelligence Information System for food- and waterborne diseases – EPIS” του ECDC, έχει τη δυνατότητα, όπως και το Γραφείο Τροφιμογενών του ΚΕΕΛΠΝΟ, να αναρτά επείγοντα αιτήματα πληροφοριών (“Urgent Inquires”) σε άλλες χώρες της ευρωπαϊκής κοινότητας αλλά και σε χώρες εκτός Ευρώπης που συμμετέχουν στο EPIS, όταν κατόπιν των εργαστηριακών ελέγχων προκύπτουν ύποπτα δεδομένα για συρροή κρουσμάτων που αφορούν ίσως μέρος επιδημίας.

Συμπερασματικά, η εργαστηριακή και επιδημιολογική επιτήρηση της Σαλμονέλλας που απομονώνεται από ανθρώπους, ζώα και τρόφιμα ζωικής προέλευσης είναι πολύ σημαντική για την προστασία της δημόσιας υγείας, και συνεπώς ενθαρρύνεται η αποστολή των σαλμονελλών που απομονώνονται από τα μικροβιολογικά εργαστήρια στο ΕΚΑΣ.

 

Βιβλιογραφία
  1. EFSA and ECDC (European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control), 2015. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2013. EFSA Journal 2015;13(1):3991, 162 pp. doi:10.2903/j.efsa.2015.3991. Available from: www.efsa.europa.eu/efsajournal
  2. Antigenic Formulae of the Salmonella serovars. 9th edition. Paris:World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella; 2007. Available from: http://www.pasteur.fr/ip/portal/action/WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089
  3. European Centre for Disease Prevention and Control. EU protocol for harmonised monitoring of antimicrobial resistance in human Salmonella and Campylobacter isolates. Stockholm: ECDC; 2014. Available from: http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/AMR-Salmonella-campylobacter-protocol-monitoring.pdf
  4. Standard Operating Procedure for Pulsenet PFGE of Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli Non-O157 (Stec), Salmonella Ssrotypes, Shigella sonnei and Shigella flexneri. Available from: http://www.pulsenetinternational.org/assets/PulseNet/uploads/pfge/PNL05_Ec-Sal-ShigPFGEprotocol.pdf
  5. EFSA (European Food Safety Authority) and ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), 2015. EU Summary Report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2013. EFSA Journal 2015;13(2):4036, 178 pp., doi:10.2903/j.efsa.2015.4036 Available from: www.efsa.europa.eu/efsajournal

Μανδηλαρά Γεωργία, Βιολόγος PhD, Επιστημονική Υπεύθυνη Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Σαλμονελλών, Σιγκελλών, βερο-τοξινογόνων, E.coli, Λιστέριας, ΕΣΔΥ-ΚΕΔΥ-ΚΕΕΛΠΝΟ