Μύθοι και αλήθειες

Μύθοι Αλήθειες
Η C. burnetii επιβιώνει και πολλαπλασιάζεται σε μακροφάγα κύτταρα με μηχανισμούς που χρησιμοποιούνται από τα περισσότερα ενδοκυττάρια βακτήρια. Για πολλά χρόνια πιστεύαμε ότι η C. burnetii δεν αναστέλλει τη σύμπτυξη του φαγοσώματος με το λυσόσωμα, αλλά αντίθετα κατάφερνε να πολλαπλασιάζεται σε ένα πλήρως σχηματισμένο φαγολυσόσωμα παρουσία υδρολυτικών και άλλων αποδιατακτικών ενζύμων. Ωστόσο, τελευταίες μελέτες δείχνουν ότι το παρασιτοφόρο φαγόσωμα απλά φέρει πρωτεϊνικούς δείκτες ώριμου φαγολυσοσώματος καθώς και το όξινο pH που βρίσκεται στο φαγολυσόσωμα χωρίς να γίνεται τελικά η σύμπτυξή του με το λυσόσωμα. Με τον τρόπο αυτό όχι μόνο καταφέρνει το βακτήριο να «κρυφτεί» από το μακροφάγο, αλλά μέσω πρωτεϊνών που εκκρίνει στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου ξενιστή με δράση τελεστή, εκμεταλλεύεται τους μηχανισμούς του κυττάρου προς όφελός του. «Κρύβεται» χωρίς να «κοιμάται», συμμετέχοντας στη βιοσύνθεση και διατήρηση του φαγοσώματος όσο καιρό επιζεί μέσα σε αυτό.
Το γένος Coxiella περιλαμβάνει ένα μόνο είδος, την C. burnetii, ο πληθυσμός της οποίας εθεωρείτο ομοιογενής και όχι ετερογενής. Οι πληθυσμοί της C. burnetii έχουν ετερογενή δομή. Η ετερογένεια του βακτηρίου αρχικά ερευνήθηκε με την PCR-RLFP και πιο πρόσφατα με τη γονοτυπική ανάλυση στελεχών οξείας και χρόνιας νόσου με τις μεθόδους MLVA και MLST, οι οποίες επιβεβαίωσαν τον πολυμορφισμό των στελεχών. Πιστεύεται ότι οι διακριτοί αυτοί γονότυποι της C. burnetii σχετίζονται με τις ποικίλες κλινικές μορφές του πυρετού Q. Επιπρόσθετα, η οξεία και χρόνια μορφή του πυρετού Q συσχετίσθηκαν με την ύπαρξη των πλασμιδίων που σταθερά διατηρούνται σε στελέχη της C. burnetii (π.χ. τα στελέχη της οξείας νόσου φέρουν το πλασμίδιο QpΗ1, ενώ της χρόνιας το πλασμίδιο QpR5). Παρά το γεγονός ότι το DNA των πλασμιδίων αυτών έχει πλήρως αλληλουχηθεί, τα μονοπάτια έκφρασης των γονιδίων τους δεν έχουν μελετηθεί σε βαθμό που να επιβεβαιώνουν την προαναφερθείσα παραδοχή. Πρόσφατα όμως ερευνητικά αποτελέσματα (Voth et al. 2011) δείχνουν ότι όλα τα πλασμίδια της C. burnetii, κωδικοποιούν τρεις πρωτεΐνες οι οποίες μετατοπίζονται μέσω του εκκριτικού συστήματος Τ4SS της C. burnetii, στο φαγόσωμα του κυττάρου ξενιστή, μέσα στο οποίο επιβιώνει ενεργά η C. burnetii (προ-επιβιωτική άμυνα ή επιθετικότητα της C. burnetii).

Πρόσφατα, διαπιστώθηκε ότι αρκετά είδη κροτώνων φέρουν βακτήρια των οποίων η αλληλούχηση των γονιδιωμάτων των τα κατέταξε στο γένος Coxiella. Τα είδη αυτά θεωρούνται υποχρεωτικά ενδοσυμβιωτικά παράσιτα και χαρακτηρίζονται ως Coxiella-like βακτήρια. Το γονιδίωμά τους έχει υποστεί εξελικτικά μεγαλύτερη μείωση από εκείνη που υπέστη η C. burnetii. Οι πιθανότητες να προκαλούν λοίμωξη στα ζώα ή στον άνθρωπο δεν έχουν ακόμα μελετηθεί (Zhong 2012).

Η C. burnetii συνθέτει μόνο ένα λοιμογόνο παράγοντα (ή προ-επιβιωτικό παράγοντα), τον λιποπολυσακχαρίτη (LPS). Η αντιγονική παραλλαγή του LPS ρυθμίζεται από το γένωμα της C. burnetii και αφορά στις μορφές έκφρασης (φάσεις) του μορίου της, τη φάση Ι και φάση ΙΙ. Η φάση Ι διαθέτει μεγάλη λοιμογόνο ισχύ (virulence), ενώ η φάση ΙΙ δεν είναι αρκετά λοιμογόνος. Η φάση Ι περιέχει σάκχαρα που δεν έχει η φάση ΙΙ. Ο LPS ΙΙ είναι η μειωτική (περικομμένη) μορφή του LPS I, ένα αποκομμένο τμήμα της, προϊόν αποκοπής (deletion) μιας σειράς γονιδίων που συμμετέχουν στη διαδικασία βιοσύνθεσης του LPS. Η φάση Ι συναντιέται σε μολυσμένους ανθρώπους, σε ζώα και σε κρότωνες. Η φάση ΙΙ εκφράζεται μετά από διαδοχικά περάσματα σε κυτταρικές σειρές και εμβρυοφόρα αυγά (στο εργαστήριο). Ο LPS I επιδρά στα πρώτα στάδια της φαγοκυττάρωσης. Αφ’ ενός ενεργοποιεί την ιντεγκρίνη ανβ3 (υποδοχείς LIC Leucocytic Integrin Response) της επιφάνειας των μονοκυττάρων και μακροφάγων του ξενιστή και αφ’ ετέρου επάγει την διείσδυση ολιγάριθμων στελεχών του παθογόνου στο σχηματιζόμενο φαγόσωμα. Συγχρόνως, απενεργοποιεί τις ιντεγκρίνες ανβ2 (υποδοχείς TR3) που επάγουν την διείσδυση πολλών βακτηρίων της φάσης ΙΙ στο φαγόσωμα. Στη διαδικασία αυτή (προσκόλληση και διείσδυση) δεν συμμετέχει μόνο ο LPS Ι αλλά και άλλες δύο πρωτεΐνες (η IAP και οι υποδοχείς TLR4), το σύμπλεγμα των οποίων ενεργοποιεί το πρώιμο στάδιο της ανοσολογικής απάντησης με την παραγωγή της IFNγ (η οποία επάγει το Th1 σκέλος της κυτταρικής απάντησης στην οξεία μορφή του πυρετού Q). Εκτός όμως από τις πρωτεΐνες αυτές η C. burnetii διαθέτει και άλλους προ-επιβιωτικούς παράγοντες διαφυγής των αμυντικών μηχανισμών του ξενιστή. Αναστέλλει την απόπτωση για να μπορέσει να επιβιώσει και να πολλαπλασιαστεί στο κύτταρο του ξενιστή. Η αναστολή όμως της απόπτωσης διαρκεί τουλάχιστον 4 εβδομάδες (Chmielewski & Tylewska-Wierzbanowska 2012). Εκτός όμως από αυτό, επάγει ένα κοινό πρόγραμμα μεταγραφής άλλων γονιδίων που εκφράζουν κυττοκίνες, χημοκίνες και άλλους διαμεσολαβητές που συμμετέχουν στην ανοσολογική απάντηση του ξενιστή. Το κοινό αυτό πρόγραμμα αναπρογραμματίζεται ανάλογα με το γονότυπο του στελέχους, τις δυνατότητες επιβίωσής του και ενδεχομένης παράτασης ή υπερβολικής έκφρασης της ανοσολογικής απάντησης.
Η C. burnetii παράγει ενδοσπόρια για να επιζήσει στο περιβάλλον και να μεταδοθεί αερογενώς. Ο ενδοκυτταρικός κύκλος ανάπτυξης της C. burnetii στο φαγόσωμα περιλαμβάνει δύο μορφολογικά λειτουργικές και συστατικά διακριτές μορφές: μια μικροκυτταρική παραλλαγή (την SCV Small Cell Variant) και μια μακροκυτταρική μορφή (LCV Large Cell Variant). Ο μεταβολισμός της SCV μορφής διατελεί «εν υπνώσει»: η μορφολογία του μοιάζει με σπορογόνο σχηματισμό, αλλά δεν είναι σπόριο. Ο περιπλασματικός του χώρος είναι γεμάτος με ένα πυκνό υλικό, στο οποίο αποδίδεται η αντοχή του σε αντίξοες συνθήκες. Η LCV μορφή είναι μεταβολικά ενεργή και μορφοποιείται σε συνθήκες αφθονίας πόρων. Σε όξινο pH η SCV μορφή διαφοροποιείται σε LCV μορφή που με την σειρά της σε συνθήκες στέρησης (στο στάσιμο στάδιο πολλαπλασιασμού στο φαγόσωμα) επάγει τον σχηματισμό της SCV μορφής που απελευθερώνεται στο περιβάλλον. Η ανάλυση του πρωτεώματος των «κυττάρων εμμονής» (persistent) έδειξε ότι η starvation sensing protein υπερεκφράζεται στα κύτταρα αυτά και όχι σε κανονικά κύτταρα (Vranakis et al. 2012). Υποθέτουμε ότι η πρωτεΐνη αυτή επάγει τον σχηματισμό των SCV και την επιβίωση της C. burnetii στα φαγοκύτταρα και στα «κύτταρα εμμονής» (persistent cells), το πρωτέωμα των οποίων έδειξε επίσης την υπερέκφραση και άλλων πρωτεϊνών (Vranakis et al. 2012). Σε συνεργασία με την ομάδα του Heinzen (Voth et al. 2011) δείξαμε ότι μερικές από τις πρωτεΐνες αυτές κωδικοποιούνται από τα πλασμίδια της C. burnetii (βλέπε ΜΥΘΟ 2) και συμμετέχουν στην επιβίωσή της μέσα από ένα άλλο πιθανό μονοπάτι και όχι από αυτό που οδηγεί στον σχηματισμό των SCV.
Ο χρόνιος πυρετός Q (ενδοκαρδίτιδα) διαγιγνώσκεται αποκλειστικά με τα κριτήρια του Duke. Η διάγνωση του χρόνιου πυρετού Q σε άτομα με υποψία ενδοκαρδίτιδας, είναι ένα πολύπλοκο «κυνήγι» ύπαρξης προδιαθεσικών παραγόντων (βαλβιδοπάθειες, ανευρύσματα, αγγειοπάθειες) και ιστορικού οξέος πυρετού Q (ιστορικό οξέος πυρετού Q όχι μόνο τους τελευταίους 6 μήνες, αλλά και αρκετά χρόνια πριν). Η αιτιολογική του διάγνωση επισφραγίζεται μόνο με την ανίχνευση του παθογόνου με μεθόδους όπως η καλλιέργεια, η PCR ή η ορολογική εξέταση. Η καλλιέργεια της C. burnetii είναι συνήθως αρνητική και η PCR σχεδόν το ίδιο, συνεπώς, η ορολογική εξέταση είναι το κλειδί για την αιτιολογική της διάγνωση. Τα διαγνωστικά κριτήρια του Duke στις αναθεωρημένες τους μορφές, ορίζουν ως μείζον κριτήριο διάγνωσης ένα τίτλο IgG φάσης I >1.800. Η ομάδα του Raοult (Raοult 2012) ορίζει ως μείζον κριτήριο τον τίτλο IgG φάσης I ≥ 6.400 και ως ελάχιστο κριτήριο έναν τίτλο μεταξύ 800 -6.400. Η τιμή IgG φάσης I ≤ 800 είναι ενδεικτική της οξείας νόσου και αντιστοιχεί σε ένα τυπικό πρόγραμμα μεταγραφής γονιδίων της Τh1 κυτταρικής απάντησης και Μ1 μακροφάγων (TNF, IL-6,IL-12,CCL2,CCL5 και CXC18). Τιμές τίτλου ≥ 6.400 υποδηλώνουν χρόνιο πυρετό Q και αντιστοιχούν σε ένα τυπικό πρόγραμμα μεταγραφής γονιδίων της Th2 κυτταρικής απάντησης και των M2 μακροφάγων (IL10, TGF-8,IL/rg, MR, CCL16, CCL13). Τιμές IgG φάσης I μεταξύ 800 – 6.400 αντιστοιχούν σε ένα συνδυασμό M1/M2 απάντησης, σε ένα άτυπο αναπρογραμματισμό συνδυαστικών μεταγραφών της Th1 και Th2 κυτταρικής απάντησης. Η μετάβαση αυτή από την οξεία στην χρόνια νόσο σύμφωνα με τις έρευνες της ομάδας του Mege (Benoit et al 2008) αντιστοιχεί σε 4 στάδια: Μ2α, Μ2b, M2c και Μ2d. Η πρόταση του Mege είναι θελκτική αλλά δεν είναι κλινικά τεκμηριωμένη. Παρόλα αυτά, η περιοχή αυτή πιθανότητα αντιστοιχεί στην περιοχή ορολογικής αβεβαιότητας μεταξύ 800 – 6.400. Με τα κριτήρια αυτά μόνο το στάδιο M2d του Mege θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως τυπικός χρόνιος πυρετός Q. Η περιοχή ορολογικής αβεβαιότητας θα μπορούσε να εκλείψει με την ανάπτυξη βιολογικών δεικτών που θα αντιστοιχούν στις κλινικές μορφές των μεταβατικών σταδίων του Mege. Με τα κριτήρια του Duke και των Ολλανδών, υπάρχει ο κίνδυνος «βάπτισης» ως χρόνιου πυρετού Q των ενδοκαρδίτιδων που δεν οφείλονται σε μόλυνση από την C. burnetii όπως συνέβη στην Ολλανδική επιδημία.

Βιβλιογραφία

  1. Chmielewski T, Tylewska-Wierzbanowska S. (2012), Q fever at the turn of the century, Polish J. Microb. vol. 17:81-93
  2. Voth D., Beare P., Howe D., Sharma U., Samoilis G., Cockrell D., Omsland A., Heinzen R., (2011), The Coxiella burnetii Cryptic Plasmid Is Enriched in Genes Encoding Type IV Secretion System Substrates, J. Bacteriol. vol. 193:1493-1503
  3. Vranakis I., De Bock P.J., Papadioti A., Samoilis G., Tselentis Y., Gevaert K., Tsiotis G., Psaroulaki A. (2011) Unraveling persistent host cell infection with Coxiella burnetii by quantitative proteomics. J Proteome Res. vol.10:4241-51
  4. Zhong J. (2012) Coxiella-like endosymbionts. Adv Exp Med Biol. vol.984:365-79

Τσελέντης Γιάννης Καθηγητής Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής
Πανεπιστημίου Κρήτης