Νεότερα στην εργαστηριακή διάγνωση του πυρετού Q

Συλλογή και συντήρηση δειγμάτων

Η μολυσματικότητα της Coxiella burnetii είναι ιδιαίτερα υψηλή και για αυτό το λόγο ο χειρισμός δυνητικά μολυσμένων δειγμάτων πρέπει να γίνεται σε συνθήκες βιοασφάλειας επιπέδου 3 από έμπειρο προσωπικό. Τα ίδια μέτρα ασφάλειας πρέπει να λαμβάνονται και στις κυτταροκαλλιέργειες αλλά και σε δείγματα από μολυσμένα ζώα. Η ανίχνευση της C.burnetii μπορεί να γίνει σε διάφορα δείγματα, ανάλογα με την κλινική εικόνα του ασθενή. Όλα τα δείγματα φυλάσσονται στους -800C και μεταφέρονται σε ξηρό πάγο στο διαγνωστικό εργαστήριο, εκτός από το ολικό αίμα που φυλάσσεται στους 40C [1].

 

Δοκιμασίες άμεσης ανίχνευσης

Καλλιέργεια

Η απομόνωση της C.burnetii από βιολογικά δείγματα διενεργείται σε κύτταρα HEL με τη μέθοδο ταχείας κυτταροκαλλιέργειας (shell-vial centrifugation technique). Οι μονοστιβάδες κυτταροκαλλιεργημάτων ενοφθαλμίζονται με το κλινικό δείγμα και ακολουθεί φυγοκέντρηση και επώαση. Η C.burnetii συνήθως ανιχνεύεται με μικροσκοπική εξέταση των μονοστιβάδων κυτταροκαλλιεργημάτων μετά από χρώση Gimenez ή με ανοσοφθορισμό [1].

 

Ανοσοανίχνευση

Η άμεση ανίχνευση της C.burnetii στους ιστούς, π.χ. σε καρδιακές βαλβίδες, είναι πολύ χρήσιμη σε ασθενείς που βρίσκονται υπό αγωγή για χρόνιο πυρετό Q. Εκτελείται μόνο σε εργαστήρια αναφοράς. Τα δείγματα εξετάζονται νωπά ή μετά από μονιμοποίηση σε φορμόλη και εμπέδωση σε παραφίνη. Η ανοσοανίχνευση εκτελείται με τεχνικές ανοσοϋπεροξειδάσης ή με ανοσοφθορισμό με πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα. Όταν πρόκειται για δείγματα εμπεδωμένα σε παραφίνη εφαρμόζεται μόνο η τελευταία μέθοδος.[1] Πρόσφατα, οι Lepidi και συν. πρότειναν μια νέα μέθοδο, την αυτοανοσοϊστοχημεία (autoimmunohistochemistry), για τη διάγνωση της ενδοκαρδίτιδας που οφείλεται σε C.burnetii [2].

 

Μοριακή βιολογία

Οι μοριακές τεχνικές ανιχνεύουν το DNA του μικροοργανισμού σε κυτταροκαλλιέργειες και σε κλινικά δείγματα όπως: δείγματα βιοψίας (π.χ. καρδιακές βαλβίδες), εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ολικό αίμα ή ορό [3]. Έχουν επίσης εφαρμογή σε τεμάχια ιστού εμπεδωμένα σε παραφίνη. Μείζον πλεονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι ότι εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ειδικότητα για τη διάγνωση λοίμωξης πριν την ορομετατροπή, γεγονός που τις καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμες όταν πρόκειται για ασθενείς με υποψία οξείας λοίμωξης, όπου οι τίτλοι αντισωμάτων είναι πολύ χαμηλοί ή μη ανιχνεύσιμοι [4].

Υπάρχει πληθώρα τεχνικών PCR οι οποίες χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια αναφοράς. Οι μέθοδοι αυτοί έχουν διάφορους DNA στόχους. Περιλαμβάνουν την κλασική PCR, την εμφωλεασμένη (nested) PCR ή την PCR πραγματικού χρόνου (real-time). Η Light-Cycler Nested PCR (LCN-PCR) έχει υιοθετηθεί για τη διάγνωση τόσο του οξέος όσο και του χρόνιου πυρετού Q [5].

 

Δοκιμασίες έμμεσης ανίχνευσης

Ορολογική διάγνωση

Στις περισσότερες περιπτώσεις η κλινική διάγνωση του πυρετού Q είναι δύσκολη, οπότε η διάγνωση βασίζεται στον ορολογικό έλεγχο, ο οποίος επιτρέπει και τον διαχωρισμό μεταξύ οξέων και χρόνιων περιπτώσεων. Υπάρχει πληθώρα διαθέσιμων ορολογικών τεχνικών, αλλά οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες είναι η δοκιμασία σύνδεσης του συμπληρώματος, ο έμμεσος ανοσοφθορισμός, η ανοσοενζυμική μέθοδος ELISA και η δοκιμασία μικροσυγκόλλησης [3]. Η ELISA έχει υψηλή ευαισθησία και καλή ειδικότητα. H δοκιμασία σύνδεσης του συμπληρώματος είναι μεν ειδική, αλλά λιγότερο ευαίσθητη από την ELISA ή τον έμμεσο ανοσοφθορισμό. O έμμεσος μικροανοσοφθορισμός αποτελεί τη μέθοδο αναφοράς και είναι απλή και αξιόπιστη [6].

 

Οξεία νόσος

Με τη χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού, στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι η ορομετατροπή ή μια τετραπλάσια αύξηση του τίτλου αντισωμάτων έναντι αντιγόνων φάσης ΙΙ είναι ενδεικτικά οξείας λοίμωξης. Η διάγνωση οξείας λοίμωξης τίθεται όταν ο τίτλος των anti-II IgM είναι ≥1:50 και ο τίτλος των anti-II IgG ≥1:200 [7]. Στη χώρα μας, λόγω ενδημικότητας της οξείας νόσου, οι τιμές cut-off για τα αντισώματα φάσης ΙΙ έχουν υπολογιστεί για τα IgM ≥1:400 και για τα IgG ≥1:960 [8]. Τα αντισώματα IgM έναντι φάσης Ι και ΙΙ είναι αυτά που πρωτοεμφανίζονται περίπου 1 έως 4 εβδομάδες από την έναρξη των συμπτωμάτων, φτάνουν τον υψηλότερο τίτλο μετά 4-8 εβδομάδες και υποχωρούν μέχρι εξαφάνισης περίπου 12 εβδομάδες μετά την έναρξη της νόσου [9]. Τα αντισώματα IgG έναντι φάσης ΙΙ ακολουθούν την εμφάνιση των IgM, φτάνουν τον υψηλότερο τίτλο περίπου 8 εβδομάδες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων και παραμένουν ανιχνεύσιμα για μεγάλο χρονικό διάστημα (έτη). Αντίθετα, τα IgG έναντι φάσης Ι αναπτύσσονται αργότερα στη διάρκεια της οξείας νόσου και παραμένουν σε χαμηλότερους τίτλους σε σχέση με τα anti-II IgG [1].

 

Χρόνια νόσος

Στον χρόνιο πυρετό Q, λόγω της παραμονής του μικροοργανισμού στις εστίες λοίμωξης (π.χ. καρδιακές βαλβίδες, αγγειακά μοσχεύματα, οστίτης ιστός), οι τίτλοι των IgG τόσο έναντι των αντιγόνων φάσης Ι όσο και φάσης ΙΙ είναι υψηλοί. Παραμονή υψηλών τίτλων anti-I IgG (1/800) 6 μήνες μετά την οξεία λοίμωξη ή επανεμφάνιση αυτών καταδεικνύουν χρόνια λοίμωξη [9]. Επιπλέον, η παρουσία IgA αντισωμάτων έναντι φάσης Ι αντιγόνων (>1/50) συνήθως συνδέεται με χρόνια λοίμωξη [1]. Αξίζει να σημειωθεί ότι τίτλος anti-I IgG>1:800 αποτελεί ένα από τα μείζονα κριτήρια Duke για τη διάγνωση της ενδοκαρδίτιδας από C.burnetii.

Με βάση την πρόσφατη βιβλιογραφία, για την αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου προτείνονται υψηλότερα cut offs. Τα νέα προτεινόμενα όρια τίτλων αντισωμάτων για τη διάγνωση της ενδοκαρδίτιδας από Coxiella burnetii είναι υψηλότερα. Πιο συγκεκριμένα, προτείνεται τροποποίηση των κριτηρίων Duke με βάση τους τίτλους των anti-I. Έτσι, ο τίτλος anti-I IgG ≥6400 αποτελεί ένα από τα μείζονα κριτήρια για τη διάγνωση της ενδοκαρδίτιδας, ενώ τίτλος anti-I IgG ≥800 και <6400 αποτελεί έλασσον κριτήριο. Οι ίδιες οριακές τιμές προτείνεται να χρησιμοποιούνται και ως κριτήρια για τη διάγνωση αγγειακής λοίμωξης ενώ δεν προτείνονται συγκεκριμένα όρια για τις υπόλοιπες κλινικές εκφάνσεις του χρόνιου πυρετού Q [10].

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι μπορεί να ανιχνευθούν διασταυρούμενες αντιδράσεις μεταξύ C.burnetii και Legionella pneumophila, Legionella micdadei και Bartonella quintanna/henselae, για αυτό το λόγο πρέπει να λαμβάνονται υπόψιν στη διαφορική διάγνωση [9].

 

Άλλες διαγνωστικές μέθοδοι

Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός είναι όπως αναφέρθηκε η μέθοδος αναφοράς, αλλά εμφανίζει χαμηλή επαναληψιμότητα λόγω αφενός της μη αυτοματοποιημένης διαδικασίας και αφετέρου της υποκειμενικότητας στην ανάγνωση των slides. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος για τον ορολογικό έλεγχο διαφορετικών κλινικών συνδρόμων, όπως της άτυπης βακτηριακής πνευμονίας και της ενδοκαρδίτιδας με αρνητική αιμοκαλλιέργεια, η οποία βρίσκει εφαρμογή στον οξύ και χρόνιο πυρετό Q. Πρόκειται για μια μέθοδο πολυπλεκτικού έμμεσου ανοσοφθορισμού με μικροσυστοιχίες (Multiplexed Automated Corpuscular Antigenic Microarray- ΙnoDiag, La Ciotat, France), η οποία συγκρίθηκε με τον κλασικό έμμεσο ανοσοφθορισμό και την ELISA με πολύ καλά αποτελέσματα [11], [12].

Βιβλιογραφία:

  1. Angelakis E and Raoult D. Q Fever. Vet Microbiol. 2010 Jan 27;140 (3-4): 297-309.
  2. Lepidi H, et al. Autoimmunohistochemistry. A new method for the histologic diagnosis of infective endocarditis. J. Infect. Dis. 2006 193, 1711–1717.
  3. Tissot-Dupont H, Raoult D. Clinical aspects, diagnosis, and treatment of Q Fever. In: D Raoult, P Parola eds. 2007 Rickettsial diseases UK: Informa Healthcare , p.291-301.
  4. Fournier PE and Raoult D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J Clin Microbiol 2003 41(11), 5094-5098
  5. Fenollar F and Raoult D. Molecular diagnosis of bloodstream infections caused by non-cultivable bacteria. Int. J. Antimicrob. Agents 2007 30 (Suppl 1), S7–S15.
  6. Maurin M and Raoult D. Q fever. Clin Microbiol Rev. 1999 October; 12(4): 518–553.
  7. Dupont HT, Thirion X and Raoult D. Q fever serology: cutoff determination for microimmunofluorescence. Clin Diagn Lab Immunol 1994 1(2), 189-196
  8. Tselentis Y, et al. Q fever in the Greek Island of Crete: epidemiologic, clinical, and therapeutic data from 98 cases. Clin Infect Dis. 1995 20(5):1311-1316.
  9. Gikas A, Kokkini S and Tsioutis C. Q fever: Clinical manifestations and treatment. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2010 8(5)
  10. Raoult D. Chronic Q fever: expert opinion versus literature analysis and consensus. J Infect. 2012 Aug;65(2):102-8.
  11. Gouriet F, et al. Comparison of the new InoDiag automated fluorescence multiplexed antigen microarray to the reference technique in the serodiagnosis of atypical bacterial pneumonia. Clin Microbiol Infect 2008; 14: 1119–1127
  12. Gouriet F, et al. Multiplexed whole bacterial antigen microarray, a new format for the automation of serodiagnosis: the culture-negative endocarditis paradigm. Clin Microbiol Infect 2008, 14: 1112–1118
Μερόπη Γκίκα
Ειδικευόμενη Ιατρός Βιοπαθολόγος
ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»