Εργαστηριακή διερεύνηση περιβαλλοντικών δειγμάτων για τις ιογενείς γαστρεντερίτιδες

Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που προκαλούν κινδύνους για τη Δημόσια Υγεία είναι φυσικοί, μηχανικοί, χημικοί, βιολογικοί που βρίσκονται στο περιβάλλον και που έχουν γνωστές ή δυνητικές επιπτώσεις στη Δημόσια υγεία. Παραδείγματα τέτοιων περιβαλλοντικών παραγόντων αποτελούν τα φυτοφάρμακα (χημικοί παράγοντες), η ιονίζουσα ακτινοβολία (φυσικοί παράγοντες), οι μικροοργανισμοί όπως τα υδατογενή παθογόνα (βακτήρια και ιοι). Μερικοί από αυτούς τους παράγοντες ανιχνεύονται στον αέρα, στα τρόφιμα, στο νερό, στο έδαφος.

Πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν ιογενείς γαστρεντερίτιδες αφορούν κυρίως μικροβιακούς παράγοντες με τους οποίους έρχονται τα άτομα σε επαφή κατά τη λήψη τροφής ή νερού. Η έκθεση σε αυτούς τους παράγοντες μπορεί να γίνει στο σπίτι, στο σχολείο, στο χώρο εργασίας, σε εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης και σχετίζεται συχνά με το είδος των τροφίμων που καταναλώνεται, τον τρόπο παραγωγής των τροφίμων και την επεξεργασία τους. Από τους σημαντικότερους παράγοντες που μπορεί να προκαλέσουν επιδημίες είναι οι ιοί που προκαλούν ιογενείς γαστρεντερίτιδες, όπως οι Νοροϊοί, ο ιός της Ηπατίτιδας Α, οι εντεροϊοί, οι ροταϊοί, οι αδενοϊοί κ.α.

H εργαστηριακή διερεύνηση της παρουσίας ιών που προκαλούν ιογενείς γαστρεντερίτιδες μπορεί να πραγματοποιηθεί με μοριακές, καλλιεργητικές και ανοσολογικές τεχνικές. H ανάπτυξη των μοριακών τεχνικών στα μέσα της δεκαετίας του ’80, παρείχε το σημαντικότερο εργαλείο για την ανίχνευση και την ταυτοποίηση των παθογόνων ιών. Αν και αρχικά οι τεχνικές αυτές ήταν κυρίως ποιοτικές, η περαιτέρω ανάπτυξη των τεχνολογιών αυτών τις τελευταίες δύο δεκαετίες έχει αυξήσει σημαντικά την ικανότητα για την ταχεία ταυτοποίηση και τυποποίηση και την ποσοτικοποίησή τους σε περιβαλλοντικά δείγματα. Αυτή η σημαντική πρόοδος έχει βοηθήσει ουσιαστικά στην αντιμετώπιση και στον έλεγχο των επιδημιών ιογενών γαστρεντεριτίδων.

Οι μοριακές τεχνικές παρέχουν μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση, αν σχεδιαστούν προσεκτικά. Έχουν τη δυνατότητα να ανιχνεύσουν πολύ μικρό αριθμό ιών σε μεγάλη ποικιλία διαφορετικών περιβαλλοντικών δειγμάτων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η απομόνωση του DNA με διάφορες μεθόδους, αυτοματοποιημένες ή μη, δεν το επηρεάζει και συνεπώς με προσεκτικό σχεδιασμό των μοριακών αντιδράσεων, δίνεται η δυνατότητα για την ακριβή ταυτοποίηση και τυποποίηση μεγάλης ποικιλίας διαφορετικών μικροοργανισμών σε ποικίλης προέλευσης δείγματα. Εκτός από τη δυνατότητα ανίχνευσης, η ταχύτητα και η εξειδίκευση των μοριακών τεχνικών έχει σαν αποτέλεσμα τη σημαντική πρόοδο στην ταχεία αντιμετώπιση θεμάτων Δημόσιας Υγείας όπως είναι οι γαστρεντερίτιδες.

Παρόλα όμως τα πλεονεκτήματά τους, οι μοριακές τεχνικές έχουν μεγαλύτερο κόστος από τις παραδοσιακές καλλιεργητικές μεθόδους. Στην περίπτωση των βραδέως αναπτυσσόμενων μικροβίων ή των ιών, οι μεγάλοι χρόνοι επώασης που χρειάζονται για την ταυτοποίηση του παθογόνου, μπορούν να καθυστερήσουν σημαντικά τη λήψη κατάλληλων μέτρων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η μοριακή ταυτοποίηση μειώνει σημαντικά το χρόνο που χρειάζεται για την ταυτοποίηση του μικροοργανισμού και συνεπώς τη λήψη των κατάλληλων μέτρων. Η μείωση του χρόνου βοηθάει σημαντικά στη μείωση του κόστους από την αποφυγή χρήσης ακατάλληλων θεραπειών, μειώνοντας παράλληλα την παραμονή των ασθενών στο νοσοκομείο.

Κατά τον έλεγχο των επιδημιών, κυρίως των υδατογενών και τροφιμογενών, οι μοριακές τεχνικές παίζουν σημαντικό ρόλο με την ταχεία δυνατότητα ανίχνευσης και ταυτοποίησης του υπεύθυνου μικροοργανισμού στα δείγματα τροφίμων ή νερών και βέβαια τη συσχέτισή του με τον ιό που απομονώθηκε από το κλινικό δείγμα και συνεπώς της πλήρους επιδημιολογικής διερεύνησης. Αυτό παρέχει τη δυνατότητα για τη λήψη άμεσων, κατάλληλων και αξιόπιστων μέτρων για την αντιμετώπιση της επιδημίας, όπως η διακοπή της παραγωγής του τροφίμου ή η απολύμανση του νερού. Εξαιτίας της σημαντικής τους ευαισθησίας (σε πολλές περιπτώσεις <10), οι μοριακές τεχνικές παρέχουν τη δυνατότητα για την ανίχνευση και ταυτοποίηση μικρού αριθμού ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα, γεγονός που συμβάλλει σημαντικά στην προστασία της Δημόσιας Υγείας απέναντι σε ιούς για τους οποίους μέχρι σήμερα δεν υπήρχαν αξιόπιστοι και ευαίσθητοι τρόποι ανίχνευσης. Επιπλέον, οι μοριακές τεχνικές και κυρίως η τυποποίηση μέσω του καθορισμού της αλληλουχίας (microbial sequence typing) έχουν δώσει μεγάλες δυνατότητες σε θέματα τυποποίησης (καθορισμό γονότυπου) και δημιουργίας των κατάλληλων φυλογενετικών δένδρων των μικροοργανισμών, βελτιώνοντας σημαντικά τις γνώσεις στο πεδίο της μοριακής τους επιδημιολογίας.

Για τον εργαστηριακό έλεγχο των δειγμάτων τροφίμων και νερών κατά τη διερεύνηση μιας τροφιμογενούς ή υδατογενούς επιδημίας ιογενούς γαστρεντερίτιδας, η διαδικασία περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Συμπύκνωση και απομόνωση των μικροοργανισμών από το δείγμα, καθαρισμός του μικροοργανισμού, ανίχνευση του μικροοργανισμού. Το τελευταίο στάδιο, αν πρόκειται να πραγματοποιηθούν μοριακές τεχνικές, προϋποθέτει και απομόνωση του νουκλεϊκού οξέος. Ορισμένες από τις μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιούνται πιο συχνά στον έλεγχο των περιβαλλοντικών δειγμάτων και κατ’ επέκταση των επιδημιών που προκαλούν είναι η PCR και οι εφαρμογές της (όπως RT-PCR, nested-PCR, RFLP, AFLP κα), η υβριδοποίηση, η τυποποίηση αλληλούχησης μικροβίων (microbe sequence typing), η Real Time PCR, τα νέα συστήματα αλληλούχησης γονιδιώματος (metagenomics systems) ή οι chip-DNA τεχνικές. Οι τεχνικές αυτές έχουν δείξει πολύ μεγάλη εξειδίκευση, ευαισθησία, εφαρμογή σε μεγάλη ομάδα ιών και ευκολία στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων. Ειδικά με την ανάπτυξη της Real Time PCR, μειώθηκε σημαντικά και η σημασία του ανθρώπινου λάθους στα αποτελέσματα (συνήθως ψευδώς θετικά λόγω επιμολύνσεων), ενώ παράλληλα επιτεύχθηκε και η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Στα περιβαλλοντικά δείγματα, οι τεχνικές που βασίζονται στην PCR έχουν εφαρμοστεί εκτεταμένα στην ανίχνευση των ιών, έχοντας αντικαταστήσει τις χρονοβόρες διαδικασίες καλλιέργειάς τους.

Η σημασία της χρήσης των μοριακών τεχνικών φαίνεται και από το γεγονός ότι η Ευρωπαϊκή ‘Ένωση μέσω του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Τυποποίησης (CEN) έχει ξεκινήσει τη διαδικασία τυποποίησης μοριακών τεχνικών για τον έλεγχο ιών στο περιβάλλον και στα τρόφιμα. Η χρήση μοριακών τεχνικών έχει ξεκάθαρα κυρίαρχο ρόλο στη Δημόσια Υγεία καθώς κινούμαστε στον 21ο αιώνα, δίνοντας σημαντική ώθηση στη βελτίωση της προστασίας του ανθρώπινου πληθυσμού από σημαντικά προβλήματα υγείας.

Η ικανότητα για ταχεία ταυτοποίηση του παθογόνου αίτιου μιας αναδυόμενης επιδημίας αυξάνει σημαντικά τις πιθανότητες επιτυχίας του κάθε παρεμβατικού μέτρου. Πολλές χώρες, μαζί με τους παγκόσμιους οργανισμούς (WHO, ECDC) ή σε άλλες χώρες μέσω ερευνητικών έργων έχουν καταβάλει μεγάλες προσπάθειες για την ανάπτυξη ολοκληρωμένων δικτύων επιτήρησης για την παρακολούθηση των τροφιμογενών ή υδατογενών παθογόνων, όπως νοροϊών, ροταϊών, εντεροϊών. Επίσης γίνονται συστηματικές προσπάθειες για να αναγνωριστεί η ταυτότητα της γενετικής δομής τους, της γεωγραφικής κατανομής και της παρουσίας τους στα τρόφιμα ή νερό που εμπλέκονται. Η γενετική παρακολούθηση των παθογόνων ιών αποτελεί σημαντικό τομέα στην επιτήρηση και τον έλεγχο μιας ιογενούς γαστρεντερίτιδας.

Βιβλιογραφία:

  1. CDC. Updated guidelines for evaluating public health surveillance systems: recommendations from the guidelines working group. MMWR 2001; 50(No. RR-13).
  2. Panackal AA, M’ikanatha NM, Tsui FC, et al. Automatic electronic laboratory-based reporting of notifiable infectious diseases at a large health system. Emerg Infect Dis. 2002;8:685—91
  3. Smolinski MS, Hamburg MA, Lederberg J. Microbial threats to health: emergence, detection, and response. Washington, DC: National Academies Press, 2003.
  4. Teutsch SM, Churchill RE. Principles and practice of public health surveillance. 2nd ed. 2000, Edited by Stephen M. Teutsch and R. Elliott Churchill, ISBN 0195138279, Oxford University Press, New York.
  5. Wagner MM, Tsui FC, Espino JU, et al. The emerging science of very early detection of disease outbreaks. J Pub Health Mgmt Pract 2001;6:51–9.
  6. Zeng X, Wagner M. Modelling the effects of epidemics on routinely collected data. Proc AMIA Ann.Symp 2001:781—5
  7. David Rodríguez-Lázaro, Nigel Cook, Franco M. Ruggeri, Jane Sellwood, Abid Nasser,Maria Sao Jose Nascimento, Martin D’Agostino, Ricardo Santos, Juan Carlos Saiz, Artur RzeŜutka, Albert Bosch, Rosina Gironés, Annalaura Carducci, Michelle Muscillo,Katarina Kovač, Marta Diez-Valcarce, Apostolos Vantarakis, Carl-Henrik von Bonsdorff, Ana Maria de Roda Husman, Marta Hernández, Wim H. M. van der Poel. Virus hazards from food, water and other contaminated environments” 2011, FEMS Microbiol Rev. 2012 Jul;36(4):786-814.
  8. P.A.Kokkinos, P.G.Ziros, D.Meri, S.Philippidou, S.Kolla, A.Galanis and A.Vantarakis “Environmental surveillance. An additional/alternative approach for the virological surveillance in Greece?” Int. J. Environ. Res. Public Health. 2011; 8(6): 1914-1922

Βανταράκης Απ., Επικ. Καθηγητής Υγιεινής, Μον. Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας,
Εργαστήριο Υγιεινής, Τμ. Ιατρικής, Παν/μιο Πατρών